ELISA實(shí)驗操作要點(diǎn)：固體樣本處理方法

固體樣本處理方法：
        固體樣本處理原則：稱(chēng)取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測，細胞內的蛋白，要先收集細胞，再用合適方法破碎，離心取上清測試。

1、組織標本：切割標本后，稱(chēng)取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話(huà)，就用液氮研磨，將植物組織放在研缽中，加入適量液氮，充分研磨。
2、細胞內蛋白樣本：
許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細胞內的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細胞，洗滌干凈，再破碎細胞，離心取上清。
（1）培養的細胞
A、動(dòng)物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復凍融（如果反復凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。
B、植物細胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細胞，以使細胞破壞并放出細胞內成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。
（2）組織的細胞
切割標本后，稱(chēng)取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。
3、土壤：稱(chēng)取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內蛋白，要破碎細胞。
4、咽拭子：加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內蛋白，要破碎細胞。
5. 植物標本的采集及保存
1、 稱(chēng)取0.1g（誤差±3%以?xún)龋┬迈r植物組織樣本，在液氮中充分研磨；
2、 加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20度過(guò)夜；
3、 于4度，8000rpm，離心1小時(shí)，取上清；
4、 上清液過(guò)C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開(kāi)樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%yi醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。過(guò)柱后的樣本真空干燥或氮氣吹干，保存備用；
5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定容）?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4度離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

樣本收集注意事項
1、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。
2、標本采集后盡快進(jìn)行實(shí)驗，若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
3、我們羅列的是通用的樣本處理方法，無(wú)法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實(shí)驗人員多參考已發(fā)表的文獻，自行設計合理的樣本處理方法。